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單細胞轉錄組測序3種技術方法

單細胞基因組測序目前主要有兩種擴增方法:MALBAC方法及MDA方法,而單細胞轉錄組目前主要有三種方法:SMART擴增技術、10×genomics技術及Andeplete技術。今天主要和大家比較下單細胞轉錄組測序的三種常用方法。

 

一、SMART擴增技術:

SMART技術的出現是一個新的里程碑。這個稱作Switching Mechanism At 5’ end of the RNA Transcript(SMART),原理實際上非常簡單:在合成cDNA的反應中事先加入的3’末端帶Oligo(dG)的SMART引物,由于逆轉錄酶以mRNA為模板合成cDNA,在到達mRNA的5’末端時碰到真核mRNA特有的“帽子結構”,即甲基化的G時會連續在合成的cDNA末端加上幾個(dC),SMART引物的Oligo(dG)與合成cDNA末端突出的幾個C配對后形成cDNA的延伸模板,逆轉錄酶會自動轉換模板,以SMART引物作為延伸模板繼續延伸cDNA單鏈直到引物的末端,這樣得到的所有cDNA單鏈的一端有含Oligo(dT)的起始引物序列,另一端有已知的SMART引物序列,合成第二鏈后可以利用通用引物進行擴增。由于有5’帽子結構的mRNA才能利用這個反應得到能擴增的cDNA,因此擴增得到的cDNA就是全長cDNA。

 

這個專利的方法是利用逆轉錄酶內源的末端轉移酶活性,只要單管,一步即可完成,不需要額外的cDNA抽提純化或者沉淀,或者額外的酶反應,只需要少至25ng的mRNA或者50ng的Total RNA就可以得到高質量、高產量的cDNA庫,更重要的是得到的cDNA能夠代表原有樣品中的mRNA的豐度,可以應用于直接擴增基因、構建cDNA文庫、已知序列釣全長cDNA(RACE),和用于芯片檢測的cDNA探針的擴增等。

 

通過SMART技術得到的主要是mRNA信息,LncRNA信息大部分會丟失,SMART技術對于RNA的質量要求較高,如果RNA出現降解會導致mRNA 5’端信息丟失。通用引物技術能保證擴增的均一性,但PCR引入的突變不能夠分析出來。

 

二、10×genomics技術:

作為單細胞測序的另一個重要里程碑,10x genomic公司于2016年2月推出10x Chromium Single Cell Gene Expression Solution,此平臺整合了儀器、試劑盒和信息學軟件,能全面對接illumina測序儀,因此可實現大量大細胞的快速高效標記、測序和分析,獲得單細胞水平的基因表達譜和差異情況,并通過對復雜細胞群體進行深入細致分析,繪制大規模單細胞表達圖譜。

 

介紹10X Genomics技術流程前,首先介紹Gel bead(凝膠磁珠)。Gel bead由凝膠珠和磁珠上的一段引物構成,首先在凝膠微珠上種上特定的DNA片段,DNA片段由三部分組成:Barcode、UMI、PolyT組成。Barcode是16個堿基的長度。一共有400萬種Barcode,一個微珠是對應于一種Barcode,通過這400萬種Barcode,可以把凝膠微珠給區分開。UMI是一段隨機序列,也就是說每一個DNA分子,都有自己的UMI序列。10個堿基長的UMI,有100萬種序列的變化(4^10  = 1,048,576),UMI的作用是為了區分哪些哪些reads是來自于一個原始cDNA分子,區分基因片段重復還是duplication及區分是真實的SNP位點還是PCR產生的突變。

 

Gel bead結構

Gel bead結構 圖片來源搜狐

 

通過10×genomics儀器將單個細胞與單個凝膠微珠通過油相混在一起,形成油包水的小微滴,接下來把細胞膜破掉,讓細胞當中的mRNA游離出來。游離出來的mRNA與小液滴中的水相混合,也就是和逆轉錄酶、結合在凝膠微珠上的核酸引物、以及dNTP底物相接觸。

 

接著,發生逆轉錄反應。mRNA與凝膠微珠上帶標簽的DNA分子相結合,在逆轉錄酶的作用下,逆轉錄出cDNA來。把這個乳濁液當中所有的水相抽出來,也就是把所有帶了標簽的cDNA分子都抽出來,再把這些cDNA分子都加上接頭,經過PCR擴增,做成illumina的測序文庫,放到Illumina的測序儀上進行測序。測序完成之后,進行數據分析。

 

10×genomics技術一次可以同時得到大量大細胞數據,但只能得到mRNA信息,LncRNA大部分信息丟失,UMI技術能很好去除認為分析引入duplication及PCR引入SNP位點。同樣對RNA質量要求高,降解同樣會引起5’端信息丟失。

 

三、Anydeplete 技術

 Anydeplete 技術

 

Anydeplete技術首先通過隨機引物進行一鏈合成,一鏈合成引入核苷酸類似物,用于酶切打斷,二鏈合成同樣引入核苷酸類似物用于保證鏈特異性。然后兩端加上接頭,接頭一條鏈也帶有核苷酸類似物,用于酶切降解。當形成單鏈文庫后,設計特異性引物與rRNA形成文庫結合,一輪退火延伸,rRNA文庫形成雙鏈結構。Reverse adaptor上帶有特異的酶切位點,當形成雙鏈結構酶切位點被識別,切去接頭,這樣rRNA形成的文庫不帶有完整的接頭,而其他文庫帶有完整接頭,通過PCR擴增富積既能得到想要的信息,包含mRNA及LncRNA信息。同樣Anydeplete技術與10×genomics技術一樣,包含分子標簽,可分析duplication及PCR產生突變位點。

 

Anydeplete技術能夠用于降解性樣本,保證5’端及3’端信息的完整,能同時得到mRNA及LncRNA信息,如果只希望得到mRNA信息,Anydeplete技術則會引起一部分數據浪費。

 

應用和優勢對比:

SMART技術可用于單細胞mRNA測序,對RNA質量要求高,RNA降解會引起5’端信息丟失,沒有分子標簽功能。

 

10×genomics技術可用于單細胞mRNA測序,對RNA質量要求高,RNA降解會引起5’端信息丟失,有分子標簽功能。

 

Anydeplete技術可用于單細胞mRNA及LncRNA測序,對RNA質量要求不高,可用于降解性樣本測序,有分子標簽功能。

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